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【後天或者元旦完結】
?有很多研究發發現晝夜節律相關因子的失調與 NSCLC 的復發和轉移有關，因此識別出晝夜節律相關因子也是目前臨床所需要的。思兔閱讀sto55.com該研究發現，HLF在早期復發的 NSCLC 組織中顯著降低，與 NSCLC 患者的早期進展與遠處轉移顯著相關。並且上調 HLF 可抑制肺定植，而沉默 HLF可促進體內 NSCLC 細胞向骨、肝和腦的轉移。
?機制：下調 HLF 促進非錨定的 NSCLC 細胞在低營養條件下的無氧代謝，通過PPARα和PPARγ轉運、激活NF-κB/p65信號通路，基因的缺失和甲基化均有助於下調 NSCLC 組織中的 HLF 的表達。HLF有可能成為臨床干預 NSCLC 的新靶點。
?雖然多種治療策略對原發性非小細胞肺癌的治療具有良好的前景，但由於其早期復發和廣泛的轉移潛力，非小細胞肺癌仍然是癌症相關死亡的主要原因。
?從名字上說，晝夜節律相關分子由一系列的時鐘基因和蛋白質組成，在睡眠周期的調節中發揮著重要作用。越來越多的研究報導，晝夜節律相關調節因子的失調通過不同的機制與腫瘤的發生和轉移有關。近年來，生物鐘基因在 NSCLC 中的作用得到了廣泛的關注。例如，在肺腺癌中，過表達CRY2、BMAL1 和 RORA 聯合下調 TIMELESS 和 NPAS2 的表達與預後良好相關，而DEC1和 TIMELESS 高表達預示著在鱗狀細胞NSCLC中較差的總生存率。
?通過分析來自癌症基因組圖譜(TCGA)的 NSCLC 數據集中的多個晝夜相關調控因子和我們之前來自Array表達(AE-meta)的整合 RNA 表達譜，在目前的研究中，我們辨認出了一個晝夜基因——肝白血病因子(HLF)，它是脯氨酸和富含酸性胺基酸的鹼性亮氨酸拉鏈轉錄因子家族(PARbZIP)的成員，在早期復發的NSCLC組織中顯著減少，這與 NSCLC 患者的早期進展和遠處轉移顯著相關。
?來自 TCGA 的 NSCLC RNA測序數據集，我們發現與相鄰正常組織(ANT)相比，NSCLC 組織中 HLF 的表達水平顯著降低。通過分析來自 TCGA 的 NSCLC 數據集，與非復發的 NSCLC 組織3年內未復發，n=72）相比，HLF 也是早期復發的 NSCLC 組織（一年內復發，n=72）中所有晝夜節律相關調節下調因子之一。
?我們之前基於 AffymetrixU133 晶片(AE-meta)結合TCGA分析的 NSCLC 整合數據譜的結果進一步表明，NSCLC 組織中 HLF 的表達顯著下調，並且在早期復發的 NSCLC 組織中進一步減少（補充圖A，B）。
圖片? Real-time PCR 和 Western 印跡分析顯示，與匹配的ANT相比，7/10對 NSCLC 組織中 HLF 的 mRNA 和蛋白水平降低(圖1C和D）。
? Western blot 分析配對 NSCLC 組織中 HLF 蛋白水平與配對 ANT 的比較。α-微管蛋白作為負載控制。
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? 1年復發 NSCLC 組織(n = 5)與3年非復發 NSCLC 組織(n =5)的HLF mRNA 表達和蛋白水平。轉錄水平歸一化為 GAPDH 表達， P<0.05。
?此外，與非復發 NSCLC 組織相比，早期復發 NSCLC 組織中 HLF 表達顯著下調（圖1E，F）。
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?不同亞型 NSCLC 及良性肺疾病組織中 HLF 免疫組化染色的典型圖片（圖A）。惡性NSCLC組織和良性肺組織中 HLF 不同免疫組化染色指數的病例數(良性肺組織，n=64;ADC， n= 204;SQC， n=112;非小細胞肺癌其他亞型，n=26)（圖B）。與TCGA(ANT)(ANT、=109、ADC、=511、SQC、=502)相比，ADC 和 SQC 中 HLF 表達下調（圖C）。來自TCGA和AE-meta的 NSCLC 數據集證明了這一點（D，E）
? Kaplan-Meier生存分析進一步顯示，與高 HLF 表達的 NSCLC 患者相比，低 HLF 表達的NSCLC 患者的無進展生存期更差(圖2F)，這與TCGA、AE-meta 和 K-MPlotter 分析結果一致(圖2G-I)。
?同樣，在低 HLF 表達的 ADC 和 SQC 患者中觀察到較短的無進展生存期(圖2J-Q)。
以上結果說明，低表達HLF與NSCLC的晚期臨床病理特徵和早期進展相關。
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?此外，HLF 的表達水平隨著臨床分級和階段（補充圖1G–I）的提高而逐漸下降(補充圖1E，F）。
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?我們首先將 NSCLC 患者分為I級至III級和I級至IV級的不同亞組，如補充圖2A-F所示，在相同病理分級下，低表達 HLF 的 NSCLC 患者的無進展生存期較高表達 HLF 的患者短。相應的，根據多個獨立數據集，包括我們的樣本(補充圖2G和H)，TCGA（補充圖2I和J），AE-Meta(補充圖2K和L)和K-M Plotter(補充圖2M?O)，在相同臨床階段的 NSCLC 患者中也有類似的發現。
?綜上所述，我們的研究結果表明，低表達 HLF 與 NSCLC 患者的早期進展和晚期臨床病理特徵顯著正相關。
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?進一步研究發現，在 NSCLC 患者中，HLF 下調與較短的局部無復發生存期和遠處無轉移生存期呈正相關(補充圖3A-D)。同樣，低表達 HLF 的 ADC 患者以及 SQC 患者(補充圖3I-L)的局部無復發生存期和遠處無轉移生存期較差(補充圖3E-H)。以上結果說明，低表達HLF促進NSCLC早期局部復發和多器官遠處轉移。
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?為了進一步確定 HLF 在 NSCLC 細胞局部肺定植和遠處轉移中的作用，首先在多個不同亞型的 NSCLC 細胞株中檢測了 HLF 的表達。
?如補充圖4A和B所示，與非癌永生化肺支氣管上皮細胞 BEAS-2B 和正常肺成纖維細胞 WI-38相比，NSCLC 細胞中 HLF 的 mRNA 和蛋白質水平差異下調。我們進一步構建了 HLF 過表達的 NCI-H1975(H1975)和 NCI-H520(H520)肺癌細胞，這些細胞表達所有 NSCLC 細胞系中HLF水平最低，並內源性下調 NCI-H460(H460)和 NCI-H1299(H1299)細胞 HLF 的表達，這兩種細胞均表達最高的內源性 HLF 水平(補充圖4C和D）。
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?採用小鼠尾靜脈模型研究NSCLC細胞的肺定植和生長能力。如圖3A-D和補充圖4E，上調 HLF 顯著抑制 H1975 細胞在肺中的腫瘤發生，表現為肺結節的形成減少，每m㎡的癌細胞數量減少，累積生存率延長。相反，沉默 HLF 對 H460 細胞有相反的效果(圖3A-C、E和補充圖4E)。
?值得注意的是，HLF 表達的改變不僅影響大肺結節的形成(在分析的腫瘤切片中定義為>50腫瘤細胞)(圖3B)，但也影響小肺結節的形成(在分析的腫瘤切片中定義為5-50個腫瘤細胞)(補充圖4E)，這支持了 HLF 在腫瘤細胞的早期定植和隨後的肺內生長中都起著重要作用的觀點。
?最後，與實驗結束時相比，在注射 HLF 穩定過表達的 H1975 細胞和下調 H460 細胞的小鼠腫瘤組織中，進一步證實了相應的高和低表達水平(補充圖4F)。
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?然後，採用體內左心室接種小鼠模型檢測 HLF 對 NSCLC 遠處轉移能力的影響，將載體/NCI-H1975、HLF 過表達 NCI-H1975、載體/NCI-H460 和 HLFsh#1/NCI-H460 細胞接種到小鼠左心室。
?接種細胞6周後，收集小鼠的脛骨、腦、肝組織，並進行 H&E 染色處理。如圖所示。圖3F-I和補充圖4G，我們在與載體組相比，過 HLF 表達小鼠組中，包括骨、大腦和肝臟等遠處器官檢測到較少的轉移性腫瘤，以及較長的累積存活期延長。
?相比之下，沉默HLF可顯著增強骨、腦和肝臟轉移瘤的形成，並縮短生存期(圖3F-I和補充圖4H)。
?因此，這些結果表明，低表達 HLF 的 NSCLC 細胞具有更強的局部定植和生長能力，以及更強的遠處轉移能力。
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?我們利用CCK-8、集落形成和An連接素凋亡進一步研究了 HLF 在 NSCLC 中的生物學功能，發現在正常培養條件下，HLF 對 NSCLC 細胞的增殖和凋亡能力沒有顯著影響(補充圖5A–C)。
?我們的結果顯示，上調 HLF 會增加培養液的PH水平，而沉默 HLF 會降低培養基的pH水平，但正常情況下 HLF 並不影響 NSCLC 細胞的表型和數量(補充圖5D)。
?低表達 HLF 可能通過營養代謝途徑促進 NSCLC 細胞對低營養狀態的適應，因為即使在正常的含氧條件下，癌細胞也更傾向於通過厭氧途徑代謝。
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?然而，上調 HLF 抑制 NSCLC 的生長，而沉默 HLF 可促進 NSCLC 細胞的錨定和懸浮生長能力(圖4A和B)，表明沉默 HLF 增強了 NSCLC 細胞在懸浮條件下的生存能力，即 anoikis 耐藥。這是各種癌症中與遠處轉移有關的轉移性癌細胞的主要特徵。
?事實上，晝夜節律基因的失調導致了 NSCLC 的代謝失調，HLF 廣泛參與了多種物質代謝過程，包括脂質和氧化代謝。
?在低血清(1%)和低葡萄糖(1g/L)培養液組成的低營養條件下，HLF 過表達抑制了
NSCLC 細胞的增殖，但增加了凋亡潛能，反之亦然（圖4C-E）。
? HLF 參與了癌細胞生長培養基的營養代謝，這是 HLF 抑制 NSCLC 細胞生長的前提條件。
?在低營養條件下觀察 NSCLC 細胞 HLF 對葡萄糖、脂肪酸和蛋白質的影響。如補充圖6A，HLF 表達的改變並不影響總蛋白含量。然而，HLF 的上調降低了葡萄糖、甘油三酯的消耗和乳酸的分泌，但增加了游離脂肪酸的水平(圖4F–I)。
?矛盾的是，上調 HLF 增加了細胞內 ATP 的總產生和 LDH 的活性(補充圖6B和C）。這些發現表明，在低營養條件下，過表達 HLF 的癌細胞更容易發生有氧代謝而不是厭氧代謝，這進一步支持了上調 HLF 降低乳酸脫氫酶(LDH)的活性，厭氧糖酵解限速酶，一些厭氧糖酵解和乳酸發酵相關基因，但增強了多個三羧酸循環相關基因(。
?相反，沉默 HLF 則表現出相反的代謝特性，促進了 NSCLC 細胞的厭氧代謝(圖4F-I和補充圖6C和D)。上訴結果表明，低表達HLF促進非小細胞肺癌細胞的厭氧代謝。
?事實上，即使在氧含量正常的情況下，癌細胞也表現出葡萄糖代謝特徵的改變，更傾向於無氧代謝，這一現象被稱為「瓦伯格效應」。綜上所述，我們的結果表明，低表達 HLF 可促進 NSCLC 細胞從三羧酸循環向厭氧代謝的首選代謝途徑的轉換，從而進一步促進細胞在低營養條件下的生長。
?為了進一步確定低營養條件下 HLF 抑制 NSCLC 生長和轉移的潛在機制，我們將多個信號通路的螢光素酶報告質粒轉染到NSCLC細胞中。如圖5A所示，上調 HLF 顯著增強了 NSCLC 細胞 PPAR 信號活性，抑制了NF-κB信號活性;相反，沉默 HLF 則產生相反的效果(圖5A)。
?基於 TCGA 的 NSCLC 數據集中 HLF 的表達進行了基因集富集分析(GSEA)，結果顯示 HLF的表達水平與 PPAR 信號呈正相關，而與 NF-κB 信號呈負相關。根據 GSEA 分析，HLF 表達與脂質氧化和糖酵解顯著相關(補充圖6F)。
?重要的是，一些證據表明，HLF 通過增加脂解誘導的游離脂肪酸積累，參與 PPAR 的易位和激活，通過破壞 p65 與靶 DNA 的結合，NF-κB 信號通路廣泛參與了癌症的進展和轉移。PPAR 信號通路由 PPARα、PPARβ/δ和 PPARγ等幾個家族成員組成。因此，確定參與 HLF 抑制 NF-κB 信號通路以及 NSCLC 腫瘤發生和轉移的特異性 PPAR 成員至關重要。
?首先，檢測10對 NSCLC 組織中PPARα、PPARβ/δ和 PPARγ的表達水平。如補充圖6G和H，PPARα在4/10對組織中表達顯著下調，PPARγ在8/10對表達，而PPARβ/δ在8/10對組織中表達上調。已有廣泛報導稱 PPARα和 PPARγ在 NSCLC 中起腫瘤抑制信號的作用，而據報導 PPARβ/δ對起致癌作用。
? Western blot 分析一致顯示，HLF 的上調增加了 PPARα和 PPARγ的總表達和核易位，增加了IκBα的表達，但降低了磷酸化的 NF-κB 和 p65 的總水平和核水平。相反，沉默 HLF 則發揮了相反的作用。因此，我們的研究結果表明，HLF 在 NSCLC 中激活 PPARα和 PPARγ，抑制 NF-κB/p65 信號通路。
?我們使用 PPARα激動劑非諾貝特、PPARγ激動劑吡格列酮和 NF-κB 信號抑制劑LY2409881，進一步研究了 PPARα/PPARγ/NF-κB/p65 信號軸在 HLF 在 NSCLC 細胞中的功能作用中的意義。
?我們的結果顯示，在 HLF 沉默的細胞中，非諾貝特和吡格列酮顯著上調了 PPAR 的活性，而 LY2409881 則沒有上。
?然而，非諾貝特、吡格列酮和 LY2409881 差異降低了 HLF 沉默細胞中 NF-κB 信號的活性。
?重要的是，非諾貝特、吡格列酮和 LY2409881 減弱了 HLF 下調對細胞非錨定生長和抗缺氧能力的刺激作用。相反，非諾貝特、吡格列酮和 LY2409881 逆轉了低營養條件下HLF下調對 NSCLC 細胞的促增殖（克隆生長）和抗凋亡作用